()原生質(zhì)體融合的影響因素

①融合劑 融合劑有化學(xué)融合劑和物理融合劑。

    現(xiàn)在普遍采用的化學(xué)融合手段是聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的化學(xué)融合法。PEG以分子橋的形式在相鄰原生質(zhì)體膜間起中介作用．改變原生質(zhì)膜的流動性能，降低原生質(zhì)膜表面勢能，使膜中的蛋白顆粒凝集，形成一層易于融合的無蛋白質(zhì)顆粒的磷脂雙分子層。在Ca 2+存在下，引起細(xì)胞膜表面的電子分布的改變，從而使接觸處的質(zhì)膜形成局部融合．出現(xiàn)凹陷，形成原生質(zhì)體橋，成為細(xì)胞間通道并逐漸擴(kuò)大，直到兩個(gè)原生質(zhì)體全部融合。PEG的分子量可分為幾種，適用的相對分子質(zhì)量為000～6000，不同種類微生物對PEG分子量的要求不同。PEG的用量為30％～50％，但隨微生物種類不同而異。

    原生質(zhì)體融合中常用的物理融合劑有電場和激光。電場融合的原理是利用電場的作用使原生質(zhì)膜穿孔導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。電融合過程中電脈沖幅度、寬度、波數(shù)和個(gè)數(shù)等因素對質(zhì)膜通透性變化都有較大影響。電融合頻率可比PEG法高十倍以上。激光融合是讓原生質(zhì)體先粘在一起，再用高峰值功率密度激光對接觸處進(jìn)行照射，使質(zhì)膜被擊穿或產(chǎn)生微米級的微孔。激光融合的優(yōu)點(diǎn)是毒性小、損傷小、定位強(qiáng)。

②無機(jī)離子PEG介導(dǎo)融合需要適量的Ca 2+ 、Mg 2+和一定的pH條件。在電場融合時(shí)．混合液中離子的存在對電場及原生質(zhì)體偶極化形成偶極子有一定的影響，會干擾融合．因此，在電融合中一般采用糖或糖醇為穩(wěn)定劑，盡量減少無機(jī)離子。

③溫度 溫度對原生質(zhì)體融合頻率有一定的影響，一般在20～30 C下處理～0min。

④親株的親緣關(guān)系 雖然原生質(zhì)體融合可以超越性障礙，但進(jìn)行原生質(zhì)體融合時(shí)是選擇親緣關(guān)系比較近的親株。因?yàn)檫h(yuǎn)緣親株融合時(shí)染色體交換后的重組體不穩(wěn)定，易分離，會影響原生質(zhì)體融合的效果。

⑤原生質(zhì)體的活性 原生質(zhì)體的活性對原生質(zhì)體融合有很大的影響，因此要制備高活性的原生質(zhì)體。

⑥細(xì)胞密度兩個(gè)親株進(jìn)行原生質(zhì)體融合時(shí)，需要一定的細(xì)胞密度．一般原生質(zhì)體的濃度要達(dá)到07～08個(gè)／mL，這樣有助于提高融合頻率。

(2)融合體的再生 融合原生質(zhì)體的再生包括融合體細(xì)胞壁和融合體的再生。細(xì)胞壁的重建只是原生質(zhì)體再生過程中的一步，當(dāng)完成原生質(zhì)體再生后，進(jìn)而發(fā)育形成菌落，整個(gè)過程稱為復(fù)原。復(fù)原不僅是指原生質(zhì)體本身長出細(xì)胞壁，而且還能從原生質(zhì)體細(xì)胞上長出有細(xì)胞壁的菌絲體。原生質(zhì)體的復(fù)原是一個(gè)十分復(fù)雜的生物學(xué)過程，其中包括細(xì)胞本身的調(diào)節(jié)和修復(fù)。

(3)融合體檢出和鑒別方法

①直接法原生質(zhì)體融合后直接分離到MM或SM上，即可直接檢出融合細(xì)胞。其優(yōu)點(diǎn)是只需一步就可得到重組體，且大多數(shù)重組體是穩(wěn)定的。缺點(diǎn)是難以檢出那些表型延遲而基因已重組的融合體。

②間接法把融合產(chǎn)物先分離到CM上，使原生質(zhì)體再生．融合和非融合的原生質(zhì)體都能生長，再分離到SM上。其優(yōu)點(diǎn)是能促使細(xì)胞壁更好地再生．表型延遲重組體容易檢出。缺點(diǎn)是需要兩步才能檢出重組體，需要相當(dāng)大人力和物力，而且得到的重組體不太穩(wěn)定。

    直接法和間接法都要用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，所得重組體不一定能提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。

③鈍化選擇法鈍化選擇法是指滅活原生質(zhì)體和具活性原生質(zhì)體融合。把親本中的一方(野生型)原生質(zhì)體在50℃熱處理2～3h，使融合前原生質(zhì)體代謝途徑中的某些酶鈍化而不能再生．再與另一方(雙缺陷型)原生質(zhì)體融合，并分離到MM上。滅活除用加熱方法外。還可用紫外線照射或藥物處理。

    總之，原生質(zhì)體融合作為發(fā)展迅速的一項(xiàng)育種技術(shù)，具有*的*性，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①原生質(zhì)體融合可以提高重組頻率；②用于原生質(zhì)體融合的雙親可以少帶標(biāo)記或不帶標(biāo)記；③通過雙親或多親本的原生質(zhì)體融合，使遺傳物質(zhì)的交換、傳遞更完整，易形成穩(wěn)定的二倍體；④原生質(zhì)體融合沒有嚴(yán)格的受體與供體之分，是一種超越性障礙的育種方法，受接合型和致育型限制小，有利于不同種間、屬間微生物的雜交；⑤利用原生質(zhì)體融合．實(shí)現(xiàn)多親融合．使各親本的整套染色體及核外遺傳物質(zhì)集中到一體，有可能增加控制代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的結(jié)構(gòu)基因的拷貝數(shù)．從而提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。

    原生質(zhì)體融合與誘變相結(jié)合，有可能實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)和加速育種進(jìn)度的目的。如把兩親株分別進(jìn)行數(shù)次誘變處理，然而進(jìn)行原生質(zhì)體融合，使相互間遺傳物質(zhì)進(jìn)行充分交換，從中有可能篩選到由各次誘變累積的能有效提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的突變基因功能都能充分發(fā)揮出來的重組體。