聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReactionm,PCR)是一項體外基因擴增技術,985年美國PE公司人類遺傳研究室發明了該項技術,Saiki等首先應用于鐮狀紅細胞貧血的產前診斷,但由于操作方法繁瑣未能全面推廣應用。直到988年耐熱DNA聚合酶(Taq酶)的發現和應用,使PCR技術變得極為簡單,才被迅速應用于分子生物學、生物工程、醫學、法醫學和農學等領域,PCR技術已經作為分子生物學發展道路上一個里程碑,永載史冊。
PCR技術的基本原理
類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:細胞
① 模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;
② 模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍(Plateau)。 到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。在此同時認識到蛋白質是接受RNA的遺傳信息而合成的。細胞