人蛋白激酶A（PKA）使用檢測說明

本試劑盒僅供研究使用。

檢測范圍：96T
8U/L – 240U/L

使用目的：本人蛋白激酶PKA試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本中蛋白激酶A(PKA)的活性。

實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中人蛋白激酶A(PKA)水平。用純化的人蛋白激酶A(PKA)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入蛋白激酶A(PKA)，再與HRP標記的蛋白激酶A(PKA)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的蛋白激酶A(PKA)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人蛋白激酶A(PKA)濃度。

試劑盒組成 
    30倍濃縮洗滌液    20ml×瓶    7    終止液    6ml×瓶
2    酶標試劑    6ml×瓶    8    標準品（480U/L）    0.5ml×瓶
3    酶標包被板    2孔×8條    9    標準品稀釋液    .5ml×瓶
4    樣品稀釋液    6ml×瓶    0    說明書    份
5    顯色劑A液    6ml×瓶        封板膜    2張  
6    顯色劑B液    6ml×/瓶    2    密封袋    個

標本要求 
．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟
標準品的稀釋：本人蛋白激酶PKA試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。
240U/L    5號標準品    50μl的原倍標準品加入50μl標準品稀釋液
20U/L    4號標準品    50μl的5號標準品加入50μl標準品稀釋液
60U/L    3號標準品    50μl的4號標準品加入50μl標準品稀釋液
30U/L    2號標準品    50μl的3號標準品加入50μl標準品稀釋液
5U/L    號標準品    50μl的2號標準品加入50μl標準品稀釋液

加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品0μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。   
配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用
洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。 
溫育：操作同3。
洗滌：操作同5。
顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色5分鐘.
終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后5分鐘以內(nèi)進行。

操作程序總結(jié)：
計算
以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。 

注意事項
．人蛋白激酶PKA試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡5-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。
0.如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

保存條件及有效期
．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6個月