大鼠（Glutamate）ELISA試劑盒操作說明

ELISA試劑盒試驗原理：

    Glutamate試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知Glutamate濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將Glutamate和標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然后加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中Glutamate的濃度呈比例關系。

試劑盒內容及其配制

試劑盒成份（2-8℃保存） 96孔配置 48孔配置 配制
96/48人份酶標板 塊板（96T） 半塊板（48T） 即用型
塑料膜板蓋 塊 半塊 即用型
標準品：800umol/L 瓶（0.6ml） 瓶（0.3ml） 按說明書進行稀稀
空白對照 瓶（.0ml） 瓶（0.5ml） 即用型
標準品稀釋緩沖液 瓶（4.0ml） 瓶（2.0ml） 即用型
標記的抗Glutamate抗體 瓶（6.0ml） 瓶（3.0ml） 即用型
親和鏈酶素-HRP 瓶（8.0ml） 瓶（4.0ml） 即用型
洗滌緩沖液 瓶（20ml） 瓶（0ml） 按說明書進行稀釋
底物A 瓶（6.0ml） 瓶（3.0ml） 即用型
底物B 瓶（6.0ml） 瓶（3.0ml） 即用型
終止液 瓶（6.0ml） 瓶（3.0ml） 即用型
標本稀釋液 瓶（2ml） 瓶（6.0ml） 即用型

自備材料

． 蒸餾水。

2． 加樣器：5ul、0ul、50ul、00ul、200ul、500ul、000ul。

3． 振蕩器及磁力攪拌器等。

ELISA試劑盒安全性

． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2． 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項

． 試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。

2． 實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

3． 不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6． 洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

7． 底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。

8． 加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

9． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

ELISA試劑盒樣品收集、處理及保存方法

、 血清-----操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，000×g離心0分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2、 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、 細胞上清液---000×g離心0分鐘去除顆粒和聚合物。

4、 組織勻漿-----將組織加入適量生理鹽水搗碎。000×g離心0分鐘，取上清液

5、 保存------如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準備

． 標準品：標準品的系列稀釋應在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：

800 umol/L （6號標準品） 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
400 umol/L （5號標準品） 00ul的原倍標準品加入00ul的標準品稀釋液
200 umol/L （4號標準品） 00ul的5號標準品加入00ul的標準品稀釋液
00 umol/L （3號標準品） 00ul的4號標準品加入00ul的標準品稀釋液
50 umol/L （2號標準品） 00ul的3號標準品加入00ul的標準品稀釋液
25 umol/L （號標準品） 00ul的2號標準品加入00ul的標準品稀釋液
0 umol/L （空白對照） 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

ELISA試劑盒操作步驟

． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。

2． 根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液：稀釋后加入50ul于反應孔內。

3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育小時。

4． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

5． 每孔加入60ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6． 甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育0分鐘。避免光照。

8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。

9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。

建議使用的實驗方案

  標準品濃度（umol/L）  
A 800 800 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
B 400 400 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
C 200 200 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
D 00 00 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
E 50 50 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
F 25 25 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
G 0 0 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品
H 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品 樣品

局限

6號標準品以上的結果為非線性的，根據此標準曲線無法得到的結果。

試劑盒性能

. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應。

3. 重復性：板內、板間變異系數均小于0%。